Исследователи из Института дизайна белков Baker Lab, исследовательского кампуса Janelia и Европейской лаборатории молекулярной биологии EMBL Heidelberg разработали новый класс искусственных флуоресцентных белковых меток NovoTags, которые позволяют находить определённые белки внутри человеческих клеток и изучать их взаимодействия с помощью современных методов микроскопии, включая сверхразрешающую. Работа опубликована в журнале Science.Современные методы визуализации позволяют изучать клетки с высокой детализацией, однако определить расположение отдельных молекул внутри сложной клеточной структуры по-прежнему трудно. Исследователи сравнивают клетку с мегаполисом, где миллионы «жителей-молекул» находятся в постоянном движении, а задача выделить среди них конкретные белки остаётся одной из ключевых проблем клеточной биологии.NovoTags представляют собой небольшие искусственно созданные белки, которые можно генетически присоединять к исследуемым белкам. После этого они связываются со специальными флуоресцентными красителями Janelia Fluor (JF), благодаря чему отмеченные молекулы становятся видимыми под микроскопом.Разработанная система расширяет возможности существующих технологий, таких как HaloTag и SNAP-tag, добавляя новые варианты для многоцветной визуализации.Изображение человеческой клетки HeLa, полученное методом флуоресцентной микроскопии сверхвысокого разрешения (STED), экспрессирующей три NovoTags, нацеленные на разные клеточные составляющие: эндосомы (пурпурный), митохондрии (зелёный) и хроматин (белый).
Фото: Steffen Klein / EMBLПервая группа NovoTag-связывающих белков была разработана для взаимодействия с тремя флуоресцентными красителями, работающими в разных диапазонах видимого спектра. Исследователи показали, что созданные белки способны влиять на оптические свойства красителей, что позволяет управлять характеристиками флуоресцентных меток на уровне молекулярного дизайна.Затем учёные EMBL разработали расширение системы — NovoSplit. В этой версии белковая метка разделена на 2 части, каждая из которых соединяется с отдельным белком в клетке. Добавление определённого красителя JF работает как «молекулярный переключатель»: оно заставляет 2 части NovoSplit собраться вместе и позволяет исследователям контролировать взаимодействие между белками в заданный момент времени.Испытания NovoTags и NovoSplit проводились в человеческих клетках с использованием методов STED-микроскопии в реальном времени и флуоресцентной микроскопии FLIM. Комбинация информации о цвете свечения и времени, в течение которого сохраняется флуоресцентный сигнал, потенциально позволяет одновременно отслеживать до 30 различных белков, используя разные комбинации спектральных характеристик и времени флуоресценции.Разработчики также рассматривают применение NovoSplit в крио-корреляционной световой и электронной микроскопии (cryo-CLEM). Этот метод объединяет изображения одной и той же клетки, полученные с помощью оптической и электронной микроскопии в естественном состоянии, что позволяет одновременно видеть расположение молекул и их ультраструктуру. В EMBL считают, что флуоресцентные cryo-CLEM-метки на основе NovoSplit могут стать инструментом для изучения крупных молекулярных комплексов внутри клеток.Создание NovoTags стало возможным благодаря специализированной модели искусственного интеллекта для проектирования белков и экспериментальным методам тестирования. Исследователи использовали алгоритмы RFdiffusion для создания белковых структур, LigandMPNN для подбора аминокислотных последовательностей, а затем проверяли кандидаты с помощью AlphaFold, RoseTTAFold и лабораторных методов анализа.Авторы работы отмечают, что новые метки могут расширить инструментарий клеточной биологии, позволив изучать белки непосредственно внутри живых клеток с большей точностью. Последовательности NovoTags и соответствующие красители уже доступны научному сообществу для дальнейших исследований и разработки новых методов визуализации.